12 resultados para Highly Active Anti Retroviral Therapy (HAART)
em ArchiMeD - Elektronische Publikationen der Universität Mainz - Alemanha
Resumo:
Weltweit sind ber 34 Millionen Menschen mit dem HI-Virus infiziert. Da die Behandlung mit der HAART-Therapie aufgrund der hohen Mutationsrate des Virus oft fehlschlgt, ist die stetige Forschung an neuen, verbesserten Wirkstoffen zwingend ntig. Mit einem neuartigen Therapieansatz, der die Aufrechterhaltung des menschlichen antiretroviralen Schutz-mechanismus durch Hemmung des APOBEC3G-Abbaus zum Ziel hat, existiert eine neue Mglichkeit zur Bekmpfung der Infektion. Im Gegensatz zu den HAART-Virustatika soll hier das menschliche Immunsystem aufrechterhalten werden, sodass es die Abwehr des Virus selbst bernehmen kann. Der durch das Virus induzierte Abbau von APOBEC3G ist gekoppelt an die Bildung eines Komplexes aus mehreren Proteinen, darunter das virale Protein vif (viral infectivity factor) und das humane Protein ElonginC. Wird eine der Interaktionen dieser Komplexbildung gehemmt, so kann APOBEC3G nicht mehr abgebaut werden und der humane Schutzmechanismus bleibt aufrechterhalten.rnDie vorliegende Arbeit widmete sich in diesem Zusammenhang der Suche nach Inhibitoren der vif-ElonginC-Interaktion. Nach Dockingstudien wurden potentielle Kandidaten synthetisiert und anschlieend zunchst mit Hilfe der Mikrokalorimetrie (ITC) und der Oberflchenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) auf ihre Affinitt zu rekombinant exprimiertem ElonginC getestet. Zustzlich wurde ein auf der Mikroskalierten Thermo-phorese (MST) basierender Bindungsassay etabliert, und die Substanzen auch mit dieser Methode getestet. Whrend die Bindung in diesen Assays nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, zeigte sich eine Substanz in In-vitro-Tests auf Hemmung der APOBEC3G- und vif-abhngigen Virusreplikation als sehr vielversprechend. Auch wenn der genaue molekulare Wirkort in weiteren Tests erst noch ermittelt werden muss, stellt diese Moleklstruktur aufgrund der bisherigen Testergebnisse bereits eine vielversprechende Basis fr weitere Derivatisierungen dar.rn
Resumo:
Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) findet Anwendung in der Therapie mit Immunosuppressiva, Antibiotika, antiretroviraler Medikation, Antikonvulsiva, Antidepressiva und auch Antipsychotika, um die Effizienz zu steigern und das Risiko von Intoxikationen zu reduzieren. Jedoch ist die Anwendung von TDM fr Substanzen, die Einsatz finden in der Rckfallprophylaxe, der Substitution oder dem Entzug von Abhngigkeitserkrankungen nicht etabliert. Fr diese Arbeit wurde im ersten Schritt eine sensitive Rating-Skala mit 22 Items entwickelt, mit Hilfe derer der theoretische Nutzen von TDM in der Pharmakotherapie von substanzbezogenen Abhngigkeitserkrankungen auf der Basis von pharmakologischen Eigenschaften der Medikamente und von Patientencharakteristika evaluiert wurde. Die vorgenommene Einschtzung zeigte fr Bupropion, Buprenorphin, Disulfiram (oder einen Metaboliten), Methadon (chirale Bestimmung wenn mglich) und Naltrexon einen potentiellen Nutzen von TDM.rnFr die meisten Medikamente, die zur Behandlung von Abhngigkeitserkrankungen zugelassen sind, fehlen valide Messverfahren fr TDM. Im Alltag werden berwiegend Drogen Screening-Tests in Form immunologischer Schnelltests angewendet. Fr die Anwendung von TDM wurden in dieser Arbeit chromatographische Verfahren fr die Bestimmung von Naltrexon und 6-Naltrexol, Bupropion und Hydroxybupropion sowie R,S-Methadon und R,S-2-Ethyliden-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidin entwickelt, optimiert und validiert. Es handelt sich dabei HPLC-UV-Methoden mit Sulenschaltung sowie zur Bestimmung von Naltrexon und 6-Naltrexol zustzlich eine LC-MS/MS-Methode. Voraussetzung fr die Interpretation der Plasmaspiegel ist im Wesentlichen die Kenntnis eines therapeutischen Bereichs. Fr Naltrexon und seinen aktiven Metaboliten 6-Naltrexol konnte eine signifikante Korrelation zwischen dem auftretenden Craving und der Summenkonzentration gefunden werden. Mittels Receiver-Operation-Characteristics-Kurven-Analyse wurde ein Schwellenwert von 16,6 ng/ml ermittelt, oberhalb dessen mit einem erhhten Ansprechen gerechnet werden kann. Fr Levomethadon wurde bezglich der Detoxifikationsbehandlung ein Zusammenhang in der prozentualen Reduktion des Plasmaspiegels und den objektiven und subjektiven Entzugssymptomen gefunden. rnDoch nicht nur die Wirkstoffe, sondern auch das Patientenmerkmal substanzbezogene Abhngigkeit wurde charakterisiert, zum einen bezglich pharmakokinetischer Besonderheiten, zum anderen in Hinsicht auf die Therapietreue (Adhrenz). Fr Patienten mit komorbider Substanzabhngigkeit konnte eine verminderte Adhrenz unabhngig von der Hauptdiagnose gezeigt werden. Die Betrachtung des Einflusses von vernderten Leberwerten zeigt fr komorbide Patienten eine hohe Korrelation mit dem Metabolisiererstatus, nicht aber fr Patienten ohne Substanzabhngigkeit.rnbergeordnetes Ziel von TDM ist die Erhhung der Therapiesicherheit und die Steigerung der Therapieeffizienz. Dies ist jedoch nur mglich, wenn TDM im klinischen Alltag integriert ist und korrekt eingesetzt wird. Obwohl es klare Evidenz fr TDM von psychiatrischer Medikation gibt, ist die Diskrepanz zwischen Laborempfehlung und der klinischen Umsetzung hoch. Durch Intensivierung der interdisziplinren Zusammenarbeit zwischen rzten und Labor, der Entwicklung von interaktivem TDM (iTDM), konnte die Qualitt der Anwendung von TDM verbessert und das Risiko von unerwnschten Arzneimittelwirkungen vermindert werden. rnInsgesamt konnte durch die eigenen Untersuchungen gezeigt werden, dass TDM fr die medikamentse Einstellung von Patienten mit Abhngigkeitserkrankung sinnvoll ist und dass optimales TDM eine interdisziplinre Zusammenarbeit erfordert.rn
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Zusammenfassung Die Rolle verschiedener Mitglieder der NFAT- Familie in der Entwicklung von T- Zellen und deren Funktion wird intensiv untersucht, wohingegen vergleichbare Untersuchungen in Mastzellen rar sind. Mastzellen exprimieren eine Vielzahl biologisch hochaktiver Mediatoren und sind auf diese Weise sowohl in angeborenen als auch adaptiven Immunantworten beteiligt. Die von Mastzellen produzierten Th2-Cytokine verstrken lokal Th2- Reaktionen und TNF-alpha ist ein wichtiger Initiator antimikrobieller Antworten. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Transkriptionsfaktoren NFATc1 und NFATc2 eine bedeutende Rolle in der Regulation der Expression von TNF-alpha und IL-13 einnehmen, wohingegen NFATc3 hierbei keine Funktion zukommt. Murine Bone marrow derived mast cells (BMMC) aus NFATc2- defizienten Musen, aktiviert entweder durch Kreuzvernetzung des IgE- Rezeptors oder Ionomycin, zeigen eine drastisch reduzierte Expression dieser Cytokine verglichen mit Mastzellen aus Wildtyp- Musen. Genauere Untersuchungen zeigen, dass sowohl NFATc2 als auch NFATc1 an der Expression von IL-13 und TNF-alpha beteiligt sind, wohingegen sie auf die Degranulation und die Expression von IL-6 keinen Einfluss nehmen. Zusammenfassend scheint eine hohe Aktivitt von NFAT- Faktoren fr die Induktion des IL-13 und TNF-alpha Promoters in Mastzellen erforderlich zu sein, unabhngig davon, ob diese durch NFATc2 oder NFATc1 oder eine Kombination beider Transkriptionsfaktoren bewerkstelligt wird.
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Das Auftreten von antigenen, fr Tumorzellen charakteristische Zelloberflchenstrukturen bildet die Voraussetzung fr eine aktive Krebsimmuntherapie, mit deren Hilfe die gezielte Bekmpfung von (Mikro-)Metastasen durch das krpereigene Immunsystem erreicht werden soll. Eine gut untersuchte Zielstruktur fr eine derartige Immuntherapie stellt das Mucin MUC1 dar, ein hochgradig O-glycosyliertes Peptid, welches bspw. von Epithelzellen der Leber exprimiert wird. rnDas Glycosylierungsmuster des tumorassoziierten MUC1 ist gegenber dem von gesunden Zellen stark verndert. In Tumorzellen kommt es aufgrund einer fehlerhaften Glucosylamintransferase-Aktivitt und einer berexpression von Sialyltransferasen zur Bildung von krzeren, hochgradig sialylierten O-Glycanketten. Allerdings wirkt sich neben der relativ schwachen Immunogenitt besonders die geringe metabolische Stabilitt des natrlichen Glycopeptidfragments nachteilig auf einen Einsatz in Krebsvakzinen aus.rnEine bislang kaum untersuchte Mglichkeit, die Stabilitt und Immunogenitt der Kohlenhydratantigene zu erhhen, knnte durch den bioisosteren Austausch von OH-Gruppen gegen Fluor erreicht werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten in 3- und 4- Position monofluorierte T-Antigene bzw. in 6-Position difluorierte T- und in 6-Position difluorierte TN-Antigene synthetisiert werden. In ersten metabilischen Tests erwiesen sich die fluorierten T-Antigene gegenber einem Abbau durch eine alpha-Galactosidase aus Rinderhoden als stabiler als ihr natrliches, nicht-fluoriertes Analogon. Diese Strukturen wurden nicht zu den entsprechenden Monosacchariden hydrolysiert und stellen somit geeignete Bausteine zur Entwicklung potenter Tumorvakzine dar.rnDie in 3- und 4-Position fluorierten T-Antigene wurden in der weiteren Synthese in eine aus 20 Aminosuren bestehende MUC1-Peptidsequenz eingebaut und durch einen nicht immunognene Spacer auf Basis von Triethylenglycol an BSA (Rinderserumalbumin) bzw. Tetanus-Toxoid angebunden. Auf diese Weise konnte die Synthese eines tumorselektiven Vakzins fertiggestellt werden.rnIn einer ersten immunologischen Evaluierung der fluorierten T-Antigen-Glycopeptide konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antikrper gegen strukturell sehr hnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Dies stellt die Grundlage fr weiterfhrende immunologische Tests dar, indem in einem nchsten Schritt das synthetisierte Tetanut-Toxoid-Konjugat als Vakzin in Experimenten an Musen zum Einsatz kommen soll.rn
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Die Aufklrung von Biosynthesewegen erfolgt hufig mit Hilfe von Ftterungsexperimenten mit radioaktiven oder stabilen Isotopen markierten Prkusoren oder auf der Basis der Enzymreinigung mit anschlieender molekularbiologischer Charakterisierung. Die erstgenannte Methode verlangt die Isolierung der Produkte. Jedoch besteht bei Aufarbeitung und Extraktion immer die Gefahr, da sich der Metabolit teilweise oder vollstndig chemisch verndert. Ein weiterer Nachteil der genannten Methoden ist, da diese generell mhsam und zeitaufwendig sind. Mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie knnen diese Nachteile umgangen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Biotransformationen und Biosynthesesequenzen des Ajmalin-Biosyntheseweges mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie in Pflanzenzellkulturen von Rauvolfia serpentina und Rauvolfia serpentina x Rhazya stricta anhand der natrlichen 13C-Hufigkeit untersucht. Dafr wurden ein 700 MHz, 800 MHz und ein 500 MHz CryoProbe Spektrometer eingesetzt, um die Biotransformationen von Isatin-3-oxim und Isatin sowie die Metabolisierungen der Alkaloide Vellosimin, Vinorin, Vomilenin, Ajmalin, N-Methyl-dihydrochano-ajmalin und Perakin mit der 1H-13C invers korrelierten NMR-Spektroskopie zu verfolgen.
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In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenprsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehrt zur Familie der lslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravense Injektion der B16-F10 Zelllinie fhrte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer hheren Lebenserwartung dieser Muse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Musen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden whrend nderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die krzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zustzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs untersttzt wurden, erklrt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Musen produzierten hhere Mengen an IFN-g whrend die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Molekle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstrkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Muse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhngigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Muse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Musen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfngermusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.
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Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-B in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy.
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Die kumulative Habil.Schrift grndet sich auf 6 Originalpublikationen, die beschreiben: [Sass, H. (1982), Cell 28: 269278]. RNA polymerase B in polytene chromosomes: Immunofluorescent and autoradiographic analysis during stimulated and repressed RNA synthesis. Elektronenmikroskopie charakterisierte das C. tentans Balbianiring BR2Gen von Speicheldrsenchromosomen als hoch aktives 56 m langes singlecopy Gen, das 33/m RNAPolymerasen B (Pol II) transkribieren (Diss., Sass, H., 1978, Univ. Tbingen). Diese Immunfluoreszenzstudie ortet Pol II in allen Interbanden von Region IV3B103B5 des nichtinduzierten BR2. Prominente Fluoreszenz im BR2Genort 3B9/10 zeigt, das BR2Gen ist praktiv, wie erwartet. 3HAutoradiogramme beweisen, in allen fluoreszierenden BR2, BR1, BR3, Puffs, aufgelockerten Banden, Interbanden und Loci ohne Puffing, synthetisiert Pol II RNA. Die genomweite stndige Pol IIPrsenz zeigt, dass, wie beim nichtinduzierten BR2Gen, bereits schon gebundene Pol II wohl auch andere Gene praktiviert. So erfolgt die Regulation der Transkription mehr ber die transkriptionelle Elongation. Auch durch Amanitin, oder Actinomycin D, oder Hitzeschock in vivo kollabierte BR2, BR1, BR3 besitzen Pol II. [Sass, H. (1984), Chromosoma 90: 2025]. Gene identification in polytene chromosomes: some Balbiani ring 2 gene sequences are located in an interbandlike region of Chironomus tentans. Immunfluoreszenz und 3HAutoradiographie zeigen, dass Injektionen von DRB in Larven die Balbianiringe (BR) sowie andere Puffs und deren Pol IIKonzentration dramatisch reduzieren. Trotzdem zeigen 3HUridin markierte Speicheldrsenchromosomen, dass RNASynthese doch in nichtinduzierten BR2, BR1, BR3 erfolgt, aber nur auf reduziertem Level. Das widerspricht der von Egyhzi E. (1975, PNAS 73:947950) propagierten Inhibition of Balbiani ring RNA synthesis at the initiation level durch DRB. Vielmehr sieht es so aus, DRB wirkt bei der transkriptionellen Elongation inhibierend. Durch in situHybridisierung von Sequenzen klonierter BR2DNA wurde in Speicheldrsenchromosom IV das BR2Gen in Region 3B9/10 direkt identifiziert. [Sass, H. and Pederson, T. (1984), J. Mol. Biol. 180: 911926]. Transcriptiondependent localization of U1 and U2 small nuclear ribonucleoproteins at major sites of gene activity in polytene chromosomes. Immunolokalisation von Sm, U1 und U2snRNPspezifischen Antigenen in Speicheldrsenchromosomen von C. tentans hat zur Entdeckung der beim Spleien von prmRNA beteiligten U1/U2snRNPs in Balbianiringen BR2, BR1, BR3 sowie anderen Puffs und aufgelockerten Banden gefhrt. Die berraschenden BRDaten zeigen erstmals: (i) Der SpleiApparat ist in Genloci mit intensiver RNASynthese schon vorhanden. (ii) Immunfluoreszenz reflektiert den ExonIntronBau dieser BRGene. (iii) Transkription und spleiosomales Ausschneiden von Introns sind koordiniert. [Sass, H. (1989), Nucleic Acids Research 17: 10508]. Hsp82neo transposition vectors to study insertional mutagenesis in Drosophila melanogaster and tissue culture cells; [Sass, H. (1990), Gene 89: 179186]. Ptransposable vectors expressing a constitutive and thermoinducible hsp82neo fusion gene for Drosophila germline transformation and tissueculture transfection. Beschrieben sind Design, Konstruktion und Expression der Genfusion hsp82neo als ein in vivo selektierbares Reporter/Markergen, die Transposons P{hsp82neo/Adh} sowie P{hsp82neo} und TransformationsVektoren pHS22, pHS24, pHS85, pHS103 und pHS104. Sie stellen das von der Fliege gebildete Enzym bakteriellen Ursprungs, NeomycinPhosphotransferase II, fr die G418Selektion bereit, um die Position, Struktur, Expression und Funktion von Genen mittels hsp82neoMutagenese zu erforschen. [Sass, H. and Meselson, M. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 67956799]. Dosage compensation of the Drosophila pseudoobscura Hsp82 gene and the D. melanogaster Adh gene at ectopic sites in D. melanogaster. Quantitative Unterschiede in der Dosiskompensation des Xchromosomalen hsp82Gens von D. pseudoobscura und autosomalen AdhGens von D. melanogaster wurden als Erhhung der RNAMenge in D. melanogaster gemessen. Beide Transgene sind dosiskompensiert, sprang P{hsp82 neo/Adh} in euchromatische Regionen des D. melanogaster XChromosoms. Beide Transgene sind nicht dosiskompensiert, insertierte P{hsp82neo/Adh} ins Heterochromatin in Region 20 an der Basis des X. Keine der zehn autosomalen Insertionen ist dosiskompensiert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Xchromosomale regulatorische Sequenzen, die fr die Verstrkung der Genaktivitt um Faktor 2 in Mnnchen verantwortlich sind, gehuft im X vorkommen, jedoch im Heterochromatin und den Autosomen fehlen. Das Kompensationsverhalten der transponierten Gene wird durch das neue chromosomale Milieu des Insertionsortes bestimmt.
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Das Glioblastoma multiforme zhlt zu den hufigsten glialen Neoplasien des Menschen und weist zudem unter den Gliomen die hchste Malignitt auf. Glioblastompatienten haben trotz aggressiver therapeutischer Anstze eine mittlere berlebenszeit von weniger als einem Jahr. Die diffuse Invasion in das umliegende Hirngewebe ist einer der Hauptgrnde fr die Rezidivbildung und die infauste Prognose von Glioblastompatienten. Neuere Untersuchungen lassen vermuten, dass die starke Invasion auch einer der Grnde fr die beobachtete anti-angiogene Resistenz bei der Behandlung von Glioblastomen ist. Das bidirektionale EphB/Ephrin-B-System wurde bei der axonalen Wegfindung als Vermittler repulsiver Signale identifiziert und auch im Zusammenhang der Migration und Invasion von Zellen berprft. In der vorliegenden Arbeit sollte daher die Funktion der bidirektionalen Eph- und Ephrin-Signaltransduktion in Bezug auf die Glioblastominvasion und Progression untersucht werden. rn Genetische und epigenetische Untersuchungen der EphB/Ephrin-B-Familie in einer Kohorte von Gliompatienten unterschiedlicher Malignittsgrade identifizierten Ephrin-B2 als mgliches Tumorsuppressorgen. In bereinstimmung damit fhrte die Inaktivierung von Ephrin-B2 in einem murinen Gliommodell zu einer verstrkten Invasion und einem erhhtem Tumorwachstum in vivo. Dies konnte in verschiedenen Invasion-Assays in vitro besttigt werden. Weiterhin zeigten unsere Untersuchungen, dass Ephrin-B2 transkriptionell durch das hypoxische Mikromilieu HIF-1-vermittelt reprimiert wird. Da HIF-1 als transkriptioneller Aktivator Ephrin-B2 nicht direkt reprimieren kann, wurden potentielle HIF-1-regulierte Repressoren untersucht, die fr die Ephrin-B2 Herunterregulation verantwortlich sein knnten. Dabei wurde anhand von Ephrin-B2-Promotoranalysen und ChIP-Assays ZEB2 als HIF-1-induzierbarer Repressor von Ephrin-B2 identifiziert. Zur Besttigung der Hypothese, dass ZEB2 ein wichtiger Regulator der Tumorinvasion ist, wurden humane ZEB2-Knockdown-Glioblastomzellen generiert und in vitro sowie in vivo untersucht. Im Hinblick auf mgliche therapeutische Anwendungen wurden die ZEB2-Knockdown-Glioblastomzellen zustzlich im Zusammenhang anti-Angiogenese-induzierter Invasion analysiert. Der Verlust von ZEB2 fhrte dabei zu einer verringerten Glioblastominvasion und Progression in einem Maus-Xenograft Modell. Die Behandlung der Tumoren mit dem anti-VEGF-Antikrper Avastin resultierte in einer stark erhhten Invasion, die durch die Inaktivierung von ZEB2 und der dadurch reaktivierten repulsiven Signale von Ephrin-B2 wieder aufgehoben werden konnte. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass Ephrin-B2 als Tumorsuppressor in Gliomen agiert und durch verschiedene Mechanismen wie der genetischen und epigenetischen Kontrolle, aber auch der HIF-1-vermittelten, ZEB2-abhngigen Repression inaktiviert wird. Dies resultiert in einer Blockade repulsiver Signale, so dass Tumorzellen diffus in das Parenchym und zu den Blutgefen migrieren knnen. Der in dieser Arbeit neu identifizierte Signalweg stellt ein attraktives therapeutisches Ziel zur Inhibition der Tumorzellinvasion dar und ermglicht darber hinaus der Ausbildung von Resistenzen gegenber anti-angiogener Behandlung entgegenzuwirken. rn
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This study presents geo-scientific evidence for Holocene tsunami impact along the shores of the Eastern Ionian Sea. Cefalonia Island, the Gulf of Kyparissia and the Gialova Lagoon were subject of detailed geo-scientific investigations. It is well known that the coasts of the eastern Mediterranean were hit by the destructive influence of tsunamis in the past. The seismically highly active Hellenic Trench is considered as the most significant tsunami source in the Eastern Ionian Sea. This study focuses on the reconstruction and detection of sedimentary signatures of palaeotsunami events and their influence on the Holocene palaeogeographical evolution. The results of fine grained near coast geo-archives are discussed and interpreted in detail to differentiate between tsunami, storm and sea level highstands as sedimentation processes.rnA multi-method approach was applied using geomorphological, sedimentological, geochemical, geophysical and microfaunal analyses to detect Holocene tsunamigenic impact. Chronological data were based on radiocarbondatings and archaeological age estimations to reconstruct local geo-chronostratigraphies and to correlate them on supra-regional scales.rnDistinct sedimentary signatures of 5 generations of tsunami impact were found along the coasts of Cefalonia in the Livadi coastal plain. The results show that the overall coastal evolution was influenced by tsunamigenic impact that occured around 5700 cal BC (I), 4250 cal BC (II), at the beginning of the 2nd millennium cal BC (III), in the 1st millennium cal BC (IV) and posterior to 780 cal AD (V). Sea level reconstructions and the palaeogeographical evolution show that the local Holocene sea level has never been higher than at present.rnAt the former Mouria Lagoon along the Gulf of Kyparissia almost four allochtonous layers of tsunamigenic origin were identified. The stratigraphical record and palaeogeographical reconstructions show that major environmental coastal changes were linked to these extreme events. At the southern end of the Agoulenitsa Lagoon at modern Kato Samikon high-energy traces were found more than 2 km inland and upt ot 9 m above present sea level. The geo-chronological framework deciphered tsunami landfall for the 5th millennium cal BC (I), mid to late 2nd mill. BC (II), Roman times (1st cent. BC to early 4th cent. AD) (III) and most possible one of the historically well-known 365 AD or 521/551 AD tsunamis (IV).rnCoarse-grained allochthonous sediments of marine origin were found intersecting muddy deposits of the quisecent sediments of the Gialova Lagoon on the southwestern Peloponnese. Radiocarbondatings suggest 6 generations of major tsunami impact. Tsunami generations were dated to around 3300 cal BC (I), around the end of 4th and the beginning of 3rd millennium BC (II), after around 1100 cal BC (III), after the 4th to 2nd cent. BC (IV), between the 8th and early 15th cent. AD (V) and between the mid 14th to beginning of 15th cent. AD (VI). Palaeogeographical and morphological characteristics in the environs of the Gialova Lagoon were controlled by high-energy influence.rnSedimentary findings in all study areas are in good accordance to traces of tsunami events found all over the Ionian Sea. The correlation of geo-chronological data fits very well to coastal Akarnania, the western Peloponnese and finding along the coasts of southern Italy and the Aegean. Supra-regional influence of tsunamigenic impact significant for the investigated sites. The palaeogeographical evolution and palaeo-geomorphological setting of the each study area was strongly affected by tsunamigenic impact.rnThe selected geo-archives represent extraordinary sediment traps for the reconstruction of Holocene coastal evolution. Our result therefore give new insight to the exceptional high tsunami risk in the eastern Mediterranean and emphasize the underestimation of the overall tsunami hazard.
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Myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) ist ein anti-apoptotisches Mitglied der Bcl-2-Proteinfamilie. Als solches ist es in der Lage, die mitochondriale Aktivierung whrend der Apoptose zu hemmen. Dadurch schtzt es Zellen bei zellulrem Stress (wie z.B. Differenzierung, Proliferation oder Virusinfektion) vor Apoptoseinduktion. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es unabkmmlich whrend der Embryogenese und in verschiedenen hmatopoetischen Zellpopulationen. Des Weiteren ist Mcl-1 als Protoonkogen in verschiedenen humanen Tumorentitten verstrkt exprimiert und kann so zu einer verminderten Apoptosesensitivitt von Tumorzellen beitragen. Auch primre humane Hepatozyten knnen nach Mcl-1-Induktion durch Wachstumsfaktorbehandlung gegenber CD95-vermittelter Apoptose geschtzt werden. Daher sollte untersucht werden, welche Bedeutung Mcl-1 im hepatozellulren Karzinom (HCC) und in der gesunden Leber einnimmt. Hierzu wurde zunchst humanes HCC-Gewebe hinsichtlich der Expression von Mcl-1 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Mcl-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in HCC-Gewebe verstrkt exprimiert ist im Vergleich zu benachbartem Normalgewebe. Auch in verschiedenen HCC-Zelllinien konnte eine starke Mcl-1-Expression nachgewiesen werden. Diese war vor allem ber den PI3K/Akt-Signalweg reguliert. Eine Hemmung dieses Signalwegs fhrte zu einer Reduktion der Mcl-1-Expression und so zu einer Sensitivierung der Zellen gegenber verschiedenen Chemotherapeutika und zielgerichteten Therapien. Des Weiteren wurde die Mcl-1-Expression spezifisch durch RNA-Interferenz gehemmt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass Zellen mit unterdrckter Mcl-1-Expression deutlich sensitiver gegenber verschiedenen Apoptose-induzierenden Substanzen reagierten. Eine kombinierte Hemmung der Mcl-1-Expression und der PI3-Kinase fhrte schlielich zu einer nochmals verstrkten Sensitivierung. Im Gegensatz dazu fhrte eine berexpression von Mcl-1 zu einer Hemmung der Apoptoseinduktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Mauslinie etabliert, welche spezifisch in Hepatozyten kein Mcl-1 exprimiert, um so die Bedeutung von Mcl-1 fr die Leber in vivo zu untersuchen. Es zeigte sich, dass Mcl-1flox/flox-AlbCre-Muse bereits im Alter von acht Wochen eine verminderte Lebergre aufweisen. Dies wurde verursacht durch spontane Apoptoseinduktion in den Mcl-1 negativen Hepatozyten. Hierdurch kam es zu einer Leberschdigung, ersichtlich durch erhhte Transaminasenwerte, erhhte Caspase-3-Aktivierung, und Schdigung der Gewebsstruktur. Zudem war als kompensatorischer Effekt die Zellproliferation erhht, ohne dass sich jedoch das Lebergewicht an das von Kontrolltieren anglich. Interessanterweise kam es in Mcl-1flox/flox-AlbCre-Musen als Folge der chronischen Leberschdigung zur Entwicklung einer Leberfibrose, ersichtlich durch eine verstrkte Collageneinlagerung. Weiterhin reagierten Mcl-1flox/flox-AlbCre-Muse wesentlich empfindlicher gegenber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Diese Daten zeigen zum einen, dass Mcl-1 zur Apoptoseresistenz von HCC-Zellen beitragen kann. Zielgerichtete Therapien, welche die Expression von Mcl-1 hemmen, knnten folglich fr die Therapie des HCCs von Interesse sein. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Mcl-1 ein zentraler anti-apoptotischer Faktor fr Hepatozyten in vivo ist.
Resumo:
Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patients immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept studybispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMABis a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies.
